Besmettelijke ziekten zoals de pest en pokken eisten in de middeleeuwen en daarna veel slachtoffers. Om verdere besmetting tegen te gaan, werden zieken geïsoleerd en verpleegd in een speciaal pesthuis dan wel ‘pockhuys’. Het eerste pesthuis in Leiden werd in 1457 gesticht aan de Aalmarkt, midden in de stad. 
In 1635 besloot het stadsbestuur dat het pesthuis een plek moest krijgen buiten de stadsmuren. Eerst kwam er een tijdelijk houten gebouw. Tegen de tijd dat het nieuwe pesthuis klaar was, in 1661, waren pestepidemieën in West-Europa al aan het uitdoven. In het huidige Pesthuis is dan ook nooit een pestpatiënt behandeld.
Het gebouw vormt een carré met acht grote zalen om een binnenplaats. Interessant is het dramatische gevelreliëf van beeldhouwer Rombout Verhulst boven de toegangspoort, waarin de pest wordt afgebeeld als een furie met een wolf; ernaast een uitgeteerde moeder die haar stervende kind vasthoudt.
Het gebouw kreeg door de jaren heen vele functies: militair hospitaal, gevangenis, opvoedingsinstituut. Van 1941 tot 1989 was hier het Nederlands Leger- en Wapenmuseum ondergebracht. Vanaf 1990 ging het Pesthuis deel uitmaken van Naturalis (entree en museumshop).
In 2019 werd het Pesthuis verkocht aan een beleggingsgroep. Tijdelijk is het een multifunctionele evenementenlocatie, maar een grondige restauratie staat op de planning. In het gebouw komen onder andere een hotel en een science centre./TdB